WRKY蛋白是植物特有的超级转录因子家族，属于锌指型转录调控因子，其家族成员含有1~2个与DNA结合的WRKY域，该WRKY域由60个氨基酸组成。WRKY在拟南芥、水稻、杨树中分别有74、109和104个成员(Pandey and Somssich, 2009)。WRKY转录因子的N端有一段高度保守的WRKY-GQK氨基酸序列，其C末端为一段锌指结构，组成一般为C₂H₂ (CX_4~5CX_22~23HXH) (Eulgem et al., 2000; Yamasaki et al., 2005)。根据WRKY域的数量和锌指结构的不同，可将WRKY转录因子分为3大类：第一类通常含有2个WRKY域，其后的锌指结构类型为C₂H₂型；第二类和第三类通常只含有1个WRKY域，第二类的锌指结构为C₂H₂型，第三类的锌指结构与其他两类不同，为C₂HC型(CX₇CX₂₃HXC) (Eulgem et al., 2000)。第三类成员在锌指结构上也存在较大差异，就拟南芥和水稻WRKY转录因子比较而言，还可以将第三类分为2个亚类，A亚类为CX₇CX₂₃HXC，B亚类为CX₇CX_nHXC (n≥24) (Wu et al., 2005)。最古老的WRKY转录调控因子拥有2个高度保守的WRKY结构域,可能起源于15~20亿年前的真核生物(余迪求等, 2006)。

WRKY转录因子能够广泛参与植物的生物与非生物的胁迫反应，对研究植物抗性具有重要价值。WRKY转录因子在转录调控中可作为转录激活子或抑制子发挥作用(Xie et al., 2005; Zhang et al., 2004)。研究表明，WRKY基因属于诱导型基因，可被多种环境条件诱导(Dong et al., 2003)。如拟南芥中WRKY3和WRKY4编码两个结构相似的WRKY转录因子，它们可被病菌和水杨酸诱导(Lai et al., 2008)；烟草NtWRKY4可明显被水杨酸诱导，但逆境胁迫对其诱导不明显。250 mmol/L NaCl盐胁迫和20% PEG6000干旱胁迫同时诱导GhWRKY4的基因表达(张娜等, 2012)。利用RNAi干扰技术，研究发现烟草WRKY4转录因子在叶片生长和生物胁迫方面具有重要作用，这在WRKY家族成员中是很少见的(Ren et al., 2010)。

目前，还没有发现关于南瓜WRKY基因家族成员的报道，本文通过克隆美洲南瓜WRKY4，并对其全序列进行生物信息学分析，为进一步研究WRKY4在南瓜中的功能及作用奠定基础。

1结果与分析
1.1美洲南瓜总RNA的提取及WRKY4基因中间序列的获得
提取的美洲南瓜总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，可见28S、18S和5S三条清晰的rRNA条带，且28S条带的亮度约是18S条带亮度的2倍(图1)，表明RNA样品完整性较好，未出现降解。经紫外分光光度计测定，A_260nm/A_280nm比值在1.8~2.0之间，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白污染。

图1 美洲南瓜总RNA 注: M: DL2000 marker; 1: 总RNA Figure 1 Total RNA from Zucchini Note: M: DL2000 marker; 1: Total RNA

根据GenBank上已提交的黄瓜WRKY4基因序列保守区域设计特异性引物P1和P2，以美洲南瓜cDNA为模板，扩增得到一个大约500 bp的特异性产物，对此片段进行回收、克隆、鉴定、测序，得到一段497 bp的cDNA序列(图2)。经BLAST分析，此序列与黄瓜WRKY4的同源性达到87%，为美洲南瓜WRKY4的一段序列。

图2 WRKY4基因扩增产物 注: M: DL2000 marker; 1: RT-PCR扩增产物 Figure 2 Amplified product of WRKY4 Note: M: DL2000 marker; 1: Amplifiedproducts of RT-PCR

1.2 WRKY4基因3'端与5'端的获得
根据美洲南瓜WRKY4基因中间序列的测序结果设计3'RACE和5'RACE特异性引物，分别进行巢氏PCR，均在第二轮扩增产物中获得清晰的特异性条带。

对扩增产物进行回收、克隆、鉴定后测序，3'RACE试验获得543 bp的cDNA片段(图3A)，出现的第一个终止密码子为TGA，3'端包含一个105 bp的UTR结构和13 bp的多聚腺苷(polyA)尾。

5'RACE试验获得903的cDNA片段(图3B)，包含一个185 bp的UTR结构。

图3 3'RACE和5'RACE第二轮PCR扩增产物 注: M: DL2000 marker; A: 3'RACE第二轮PCR扩增产物; B: 5'RACE第二轮PCR扩增产物 Figure 3 Amplified product of the second round between 3'RACE and 5'RACE Note: M: DL2000 marker; A: Amplified product of the second round between 3'RACE; B: Amplified product of the second round between 5'RACE

1.3 WRKY4基因全长序列的获得及分析
根据中间片段序列和RACE试验结果，获得的3个cDNA片段进行拼接，最终得到长度为1 722 bp (图4)的美洲南瓜WRKY4基因cDNA全长序列。根据拼接得到的WRKY4序列设计引物，RT-PCR得到的产物经回收、克隆、鉴定后测序，得到的序列与拼接序列完全一致，证明得到南瓜WRKY4基因全长。经NCBI ORF (开放阅读框) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找，确定最大开放阅读框长1 419 bp，编码472个氨基酸，预测分子量约为51.40 KD，等电点为8.36，GenBank登录号为JX096811。

图4 美洲南瓜WRKY4的cDNA序列及推导的氨基酸序列 注: 灰色区域为WRKY家族的特征序列‘WRKYGQK’ Figure 4 Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of cDNA encoding WRKY4 in Zucchini Note: The gray area indicates  the characteristic sequences of ‘WRKYGQK’ in the WRKY family

1.4 WRKY4基因的生物信息学分析
利用推导的蛋白序列在NCBI Conserved Domain Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/dd/wrpb.cgi)上检索，发现其第168个到174个氨基酸和第339个到第345个氨基酸含有WRKY保守结构域。实验克隆到的美洲南瓜WRKY含有2个WRKY结构域，表明其属于第一类WRKY家族成员。

蛋白序列通过NCBI中的BLAST分析，发现该基因与黄瓜(Cucumis sativus) WRKY同源性最高，为76%，与葡萄(Vitis vinifera) WRKY32、大豆(Glycine max) WRKY24、拟南芥(Arabidopsis thaliana) WRKY32的同源性分别为63%、65%、61%。

为了分析美洲南瓜WRKY4与其他植物WRKY基因间的亲缘关系，利用DNAMAN软件，将不同植物的WRKY蛋白构建系统发育树(图5)，系统进化关系分析表明，美洲南瓜WRKY与黄瓜和毛白杨中的WRKY蛋白亲缘关系最近，与橡胶树等植物中的WRKY蛋白亲缘关系较远。

图5 植物中WRKY蛋白的系统发育树 注: 1: 橡胶树(AEE81757); 2: 大豆(ABY84663); 3: 苜蓿(AES77535); 4: 陆地绵(ADI52618); 5: 蓖麻(EEF50803); 6: 泥糊菜(EFH66291); 7: 拟南芥(AAL13048); 8: 小麦(ACD80361); 9: 毛白杨(ACV92032); 10: 美洲南瓜(JXO96811); 11: 黄瓜(ADU52501); 12: 甘蓝型油菜(ACI14396); 13: 水稻(ABC02814); 14: 玉米(ACG42925) Figure 5 Phylogenetic tree of WRKY protein in plants Note: 1: Hevea brasiliensis (AEE81757); 2: Glycine max (ABY84663); 3: Medicago truncatula (AES77535); 4: Gossypium hirsutum (ADI52618); 5: Ricinus communis (EEF50803); 6: Lyrata (EFH66291); 7: Arabidopsis thaliana (AAL13048); 8: Triticum aestivum (ACD80361); 9: Populus tomentosa (ACV92032); 10: Zucchini WRKY4 (JXO96811); 11: Cucumis sativus (ADU52501); 12: Brassica napus (ACI14396); 13: Oryza sativa (ABC02814); 14: Zea mays (ACG42925)

2讨论
植物在长期进化过程中，形成了一系列防卫机制，以抵御和适应各种生物及非生物胁迫。WRKY转录因子在植物的逆境胁迫信号转导过程起着重要作用(李淑敏等, 2008)。WRKY基因最早在甜薯中被发现，之后在野燕麦、皱叶欧芹、拟南芥、烟草中相继被发现(Eulgem and Somssich, 2007)。不同植物WRKY蛋白序列分析表明，WRKY蛋白在氨基酸序列上有一定保守性，进而揭示了它们在生物学功能上也有一定的相似性。随着更多的WRKY蛋白在不同物种中的发现，越来越多的证据表明WRKY转录因子对植物的生长发育及胁迫反应有着相当重要的作用。

目前，在发表的文章中还没有发现有关南瓜WRKY家族成员的信息。本文首次从南瓜类植物中克隆到WRKY家族成员WRKY4，填补了在南瓜WRKY家族成员报道上的空白。对南瓜WRKY4全序列进行初步分析，表明南瓜WRKY4含有两个WRKY保守域，属于最古老的WRKY家族成员之一。南瓜WRKY4的获得，为进一步研究其在南瓜中的作用机制奠定了基础，同时可以利用其同源性，研究南瓜与其他植物的进化关系。本实验后续工作，利用荧光定量PCR进一步分析确定其在水杨酸胁迫下，WRKY4基因在南瓜中的表达。目前WRKY转录因子的研究主要集中在基因克隆，表达及相关功能分析等方面，而对其参与的植物胁迫应答过程并不清楚，WRKY转录因子在植物中抗逆信号的转导途径也有待进一步分析研究。随着转录研究的不断深入和分子生物学水平的不断提高，人们对WRKY家族的作用机理及其相关功能将会逐步了解。

3材料与方法
3.1试材与主要试剂
美洲南瓜(Cucurbita pepo)种子由北京农学院蔬菜育种课题组提供。供试材料于2011年种植于北京农学院温室大棚，选取两片子叶充分展开的植株，用液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用。总RNA抽提试剂盒以及DNA胶回收试剂盒购于上海生工生物工程有限公司；M-MLV反转录酶、连接载体PMD19-T Vector和RACE试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；大肠杆菌DH5α购于北京天根生化科技有限公司。

3.2 RNA提取和cDNA合成
采用UNIQ-10柱式Trizol试剂盒提取总RNA，利用DNaseⅠ(TaKaRa)除去总RNA中混有的少量DNA，用去蛋白液RW1 (博迈德)除去总RNA中的蛋白，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。cDNA合成体系体积为20 μL，过程为：总RNA与50 μmol/L Oligo(dT) 18混合液于70℃水浴10 min；再加入M-MLV反转录酶(200 U)、dNTP (10 mmol/L)、RNase抑制剂(40 U)及灭菌的双蒸水，置于42℃水浴60 min；最后置于70℃变性15 min。

3.3 WRKY4基因中间片段的克隆
根据已报道的黄瓜WRKY4基因序列的保守区域设计一对特异性引物P1和P2 (表1)，以总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行RT-PCR。20 μL反应体系：10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺ plus) 2.5 μL，模板1.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 1.5 μL，P1和P2引物各1 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.5 μL，ddH₂O 12 μL；所用反应程序为：94℃ 5 min，94℃ 30 s，53℃ 40 s，72℃ 1 min，35次循环，最后72℃ 10 min，产物4℃保存。回收PCR产物，连接载体并转化感受态细胞，通过蓝白斑筛选及PCR阳性克隆鉴定后测序。

3.4 WRKY4基因3'末端的克隆
根据中间片段的测序结果，用Primer 5软件设计特异性引物3'GSP1 (表1)，为了提高产物特异性，在3'GSP1下游设计一个巢氏引物3'GSP2 (表1)。通用引物为3'OUT Primer (表1)，3'Inner Primer (表1)。

表1 WRKY4克隆引物序列 Table 1 Primer sequences for WRKY4 cloning

参考TAKARA公司3'RACE 试剂盒操作流程，进行第一轮PCR，20 μL反应体系：ddH₂O 5.25 μL，1×Cdna Dilution BufferⅡ 8 μL, 10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺ plus) 2.5 μL, 3'GSP1 (10 μm/L) 1 μL, 3'OUT Primer 1 μL, 3'cDNA 2 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.25 μL。PCR反应程序中退火温度为65℃，其他条件与克隆中间片段所用程序相同。

选取第一轮PCR产物2 μL为模板，进行巢氏PCR，dH₂O 4.25 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 9 μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺ plus) 2.5 μL，3'GSP2(10 μm/L) 1 μL，3'Inner Primer 1 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.25 μL。反应条件与第一轮PCR相同。

巢氏PCR扩增产物经回收、克隆以及鉴定后，进行测序。

3.5 WRKY4基因5'末端的克隆
根据中间片段的测序结果，用Primer 5软件设计特异性引物5'GSP1 (表1)，为提高产物特异性，在5'GSP1上游设计一个巢氏引物5'GSP2 (表1)。通用引物为5'OUT Primer (表1)，5'Inner Primer (表1)。实验操作过程参考TaKaRa公司5'-Full RACE 试剂盒说明进行。

第一轮PCR为20 μL的反应体系：1×cDNA Dilution BufferⅡ8 μL，dH₂O 5.25 μL，5'OUT Primer (10 μm/L) 1 μL，5'GSP1 (10 μm/L) 1 μL，5'cDNA 2 μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺ plus) 2.5 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.25 μL。PCR反应程序中退火温度为60℃，其他条件与克隆中间片段所用程序相同。

取第一轮PCR产物2 μL为模板，进行第二轮PCR，dH₂O 4.25 μL, dNTP Mixture(2.5 mmol/L each) 9 μL, 10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺ plus) 2.5 μL, 5'GSP2 (10 μm/L) 1 μL, 5'Inner Primer 1 μL, LA Taq (5  U/μL) 0.25 μL。PCR反应中退火温度为52℃，其他条件与第一轮相同。将第二轮PCR产物经回收、克隆、鉴定后测序。

3.6 WRKY4基因全长的克隆
根据拼接得到的WRKY4全长序列设计特异性引物F1、R1 (表1)，以总RNA反转录得到的cDNA为模板进行RT-PCR，反应程序与克隆中间片段的PCR程序相同，退火温度为50℃。将PCR产物回收、克隆、鉴定后测序。

作者贡献
徐岭贤是本研究的实验设计和实验研究的执行人；徐岭贤及赵福宽完成数据分析；郝芮及孙清鹏参与实验设计，试验结果分析；赵福宽是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由北京市属高等学校人才强教计划资助项目(PHR200907136)资助。

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